大脑的某些改变可能反映了恐惧学习，但目前还没有已知的标志物（markers）来预示是否厌恶经历将发展成为恐惧记忆。研究者探究了人类恐惧学习的动态过程，对单试次磁共振成像数据进行多体素模式分析（multi-voxelpattern analysis，MVPA），结果发现恐惧学习时的神经模式可以预测长期恐惧记忆的行为表达。本研究发表在Nature Neuroscience杂志。

研究背景

虽然我们知道增强或削弱恐惧记忆的过程，但我们对这些事件如何表征、加工以及最终得以改变大脑的神经结构仍尚不清楚。记忆研究的内在限制（包括恐惧条件化）是我们只能从恐惧学习过程中的行为（例如，大鼠冻结、人类的生理反应）与之后的记忆保存测试中的行为相似程度来推断出恐惧记忆。尽管学习过程中的恐惧表达肯定与长期记忆有关，但我们学到的许多内容最终并不会转变为长期记忆。多模态磁共振成像的分析非常适宜于研究恐惧记忆，与传统的脑激活分析（即基于单个体素的分析方法）相比，多模态磁共振成像是基于多个voxel的活动所构成的一种pattern的分析，能提供更多的认知状态的表征。

值得注意的是，恐惧记忆的核心不是对威胁刺激有意识地处理和对事件的事实记忆，而是对恐惧的自动化情绪表达。研究者研究者将（fMRI）与在恐惧联结学习和记忆力测试中的行为反应（即，瞳孔扩张反应）相结合起来，探索是否可以通过学习过程中的神经模式相似性来评估长期程序性恐惧记忆的形成。
研究方法

包括恐惧条件化阶段和记忆阶段（图b，c）。在恐惧条件化阶段，被试被告知,6个图片刺激中有两个会伴随电击(CS+neg)；有两个会伴随声音(CS+neut)，还有两个会单独出现(CS–），他们需要学习刺激之间的联结规律。在记忆阶段，被试被告知在第一个run不会有电击或者是声音，作为基线。接着再将电极片固定在被试脚踝处，但实际上并不会出现电击或声音（恐惧记忆保存测试）。恐惧条件化阶段中，3张面孔中，一张50%的情况下会伴随电击(CS+neg)；一张50%会伴随声音(CS+neut)，另外一张单独出现(CS–），3张房子图片也是这样配对。这六种刺激之间的顺序是固定的，但也有一些试次中刺激随机呈现，电击与声音也只在这些trial中出现，有电击及声音的试次不做之后的数据分析。

研究者采用了试次相似性分析（trial-by-trial similarity analysis）来检验恐惧联结的形成、激活和消退，来探究神经模式的相似性是否可预测长期恐惧记忆的形成。该研究对每个试次单独建模。对于38名被试，研究者创建了一个包含BOLD fMRI信号空间模式的向量，包括6个兴趣区（ROIs）：前扣带回皮层（ACC），脑岛，杏仁核，海马，腹侧前额叶皮层（vmPFC）和上额额回（SFG）。 接下来，研究者将每个向量与其他刺激表示有关的所有其他向量相关联，从而得出42×42的相似性矩阵（图1）。感兴趣的相关性包括相同刺激的两个连续相同刺激；以及不同刺激对之间的相关性，包括属于同一类别（原始类别，都是面孔或都是房屋）的刺激以及共享一个联结的结果（基于学会的联结类别，都与电击匹配或都与声音匹配）。不同刺激之间的相似性的特点在于关注共同的结果而不是关注单个预测因素，更反映了一种基于高阶认知过程的学习（图2）。

图1 恐惧学习过程中，上额额回相同刺激（对角线）与不同刺激之间的模式相关性。不同刺激的相关包括：属于同一类别或联结的刺激相同。

图2 不同刺激对之间的相关性，包括属于同一类别（原始类别，都是面孔或都是房屋）的刺激以及结果相同（基于学会的联结类别，都与电击匹配或都与声音匹配）。

研究结果

图3 在不同的实验阶段，神经模式相似度与平均激活度之间的关系（a，b）。 ACC（前扣带回皮层），杏仁核和SFG（上额额回）中刺激模式的相似度（相同分类刺激或相同联结结果刺激）

（a）和平均单试次激活（面部和房屋的平均值）

（b）揭示了恐惧联结学习的形成，重建及消退。与基于单个体素的分析方法相比，相似性分析的敏感性高，揭示了传统恐惧回路之外的大脑区域环路。
表1：在六个解剖ROI中学习阶段（n = 38，受试者内部ANOVA）的fMRI数据的统计摘要。所有显著值（P <0.05）用斜体表示，达到FDR校正显著性的用粗体表示。

NT =未检验：没有显著刺激类型主效应的脑区没有检验试次效应。

上标a代表不是由CS+ neg刺激值明显较高引起的效果。

逐试次相似性分析的应用揭示了清晰的学习曲线，该曲线反应了关联恐惧的形成（刺激内：试次[6]×刺激[3]，刺激间：试次[7]×刺激[4]；所有P≤0.004，Pη2在0.06-0.22之间；图3a，表1）（译者注，文中未列出试次主效应的表格，但按文章思路应为显著）。被试在2-6周后返回，进行记忆阶段实验（平均= 22.18±6.4天）。在没有连接电极的情况下，暴露于先前学习的CS + neg刺激不会引起不同的模式相似性。装上电极后，会再次出现不同的模式相似性，并且由于不再提供厌恶的结果，模式相似性最终消失。为了将我们的方法与标准单变量分析进行比较，研究者检查了在ROI中所有体素上平均的单试次激活。尽管交互作用效应未达到FDR校正的显著性（所有P≥0.033；表1），但是这产生了与在ACC和脑岛的相似性分析所获得的相似的学习曲线和消失曲线。（图3b）。

图4.长期程序性恐惧记忆将学生的瞳孔扩张和神经模式相似性分开。学生的瞳孔扩张反应（n = 35）显示出差异性学习和恐惧消退。根据消退阶段前三项试次中瞳孔反应的差异，将参与者分为保留组（对于瞳孔数据，n = 19；对于MRI数据，n =22a；）或不保留组（n = 16；b）。尽管学习过程中瞳孔反应的差异并不能预测随后的瞳孔反应，但是在包括vmPFC（b）在内的几个大脑区域中，差异模式的相似性确实如此。

与相似性分析的结果类似的是，在调节过程中，与CS+neut（伴随声音）和CS-（单独出现）刺激相比，CS+neg（伴随电击）刺激引起的瞳孔扩大增加也证明成功的恐惧调节（试次[13]×刺激[3]，F24,816 =9.15，P<0.0005，Pη2= 0.21）。在没有连接电极的情况下，先前学习过的CS+neg刺激的存在并不会引起瞳孔反应的增强。安装电极后，再次出现差异的瞳孔反应（刺激主效应，P <0.0005，Pη2=0.43），并最终消失（试次[13]×刺激[3]，F24,816 =2.49，P <0. 0005 ，Pη2=0.07）。这些发现证实了条件性瞳孔扩张反应作为恐惧行为的量度的有效性。即恐惧学习过程还可通过瞳孔扩张来反应出来：恐惧学习阶段，被试的瞳孔逐渐扩张；记忆测试阶段，瞳孔逐渐缩小；记忆保存测试阶段（固定上电极片之后）后，被试表现出恐惧重建，瞳孔又出现扩张反应，电击一直不出现导致消退效应出现，瞳孔逐渐缩小。

在消退阶段的前三个试次之后，瞳孔差异反应迅速减弱（第二次消退对第三次消退试次，F1,37 = 0.14，P = 0.713；第三次消退对第四次消退试次，F1,37 = 8.10，P = 0.007），表明消退学习在第三次试次后开始。为了预测恐惧记忆的长期表达，研究者根据38名参与者的恐惧记忆行为表达对其进行了分类（图4a），这些恐惧记忆是在消退学习变得明显之前的前三个保留试次中平均得到的。如果与四个对照刺激中的任何一个相比，如果参与者对CS+neg面部刺激以及对CS+neg房屋刺激表现出较强的瞳孔反应，则将他们分配给保留组（n=22）。其余的参与者被分配到无保留组（n=16）。各组在主观和程序变量上没有差异。

对于刺激之间的模式相似性，研究发现保留组在初始恐惧学习过程中的刺激活动差异大于无保留组（ACC、脑岛、杏仁核、海马、vmPFC；SFG有这种趋势但不显著）。而刺激内的模式相似性，在组间没有显著差异。值得注意的是，记忆保留组与记忆无保留组的瞳孔反映在恐惧学习阶段的无显著差异。

两组的随访测试分别显示，在所有区域的保留组中，都有强烈的恐惧学习能力（表现为差异化的模式相似性）。但无保留组表现出出不同的模式。对于这组被试，在杏仁核，海马和vmPFC中未观察到恐惧学习，但在ACC，脑岛和SFG中观察到一些恐惧学习。连续评估模式相似性的预测值显示，恐惧学习期间ACC，脑岛，vmPFC和SFG的刺激模式相似性之间的差异与保留试次间随后的瞳孔扩大之间存在线性关系。同样地，恐惧学习过程中瞳孔反应的差异并不能预测测试中瞳孔反应的差异。

至关重要的是，研究者发现平均激活并不能预测恐惧记忆在任何ROI或大脑其他任何地方的后期表达。同时，研究者仅对任务有响应的体素重复了ROI分析。这增强了模式相似性和均值激活的学习效应，但也再次说明，程序性恐惧记忆的预测仅限于刺激之间的模式相似性。尽管刺激内模式相似性不能清楚地预测程序性恐惧记忆，但研究者通过证明在海马体中，相对于之后被记住的刺激，其内刺激模式相似性高于之后被遗忘的刺激，这和重复陈述性记忆的其他发现相一致。

总而言之，对单个刺激的表征（刺激内）似乎与更高级的恐惧联结（刺激之间的相似性）是不一样的。只有刺激之间的神经模式相似性可以预测恐惧记忆的后期行为表达。高阶认知的恐惧表达以神经模式变化来表征学习可能为检查恐惧记忆是否形成提供证明。
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